Глубокое секвенирование ампликонов
Требования к качеству ДНК
Наиболее адекватным способом, отражающим степень чистоты и достаточность количества выделенной ДНК для метагеномного анализа, является проведение ПЦР со специфичными праймерами (16S/ITS/18S или др.). Однако, эффективность ПЦР с обычными праймерами и метабаркодными праймерами, несущими в своем составе дополнительные адаптерные последовательности, значительно отличается, что накладывает дополнительные требования к качеству ДНК.
Если вы решили выделять ДНК самостоятельно, то прежде чем отсылать образцы необходимо предоставить:
1) Электрофорез ПЦР-фрагментов, полученных с выделенной ДНК. Количество циклов должно быть не более 30. Должен присутствовать отрицательный контроль (ПЦР с воды). Обязательно должен быть нанесен маркер длин.
2) Спектр поглощения (200-300 нм) образцов ДНК (например на Nanodrop). Спектр должен быть классическим с максимумом на 260 нм и минимумом на 230 нм. Соотношение A260/ A280 ~1.6-1.8, а A260/ A230 в пределах 2-2.2. Неклассический спектр означает, что вам необходимо провести дополнительную очистку переосаждением или другим способом.
3) Флуориметрическое измерение общего количества ДНК, например, на Qubit (Thermo Fisher Scientific). Очень желательно, чтобы ДНК было не менее 10 нг и это значение не должно отличаться более чем на 20% от количества определенного при A260 на спектрофотометре.
4) В том случае, если спектр поглощения был классический, но отличия (Nanodrop/Qubit) тем не менее значительные, это с большой вероятностью связано c наличием в образце РНК. Необходимо проверить этот факт, проведя измерение РНК на Qubit (Thermo Fisher Scientific). В случае подтверждения присутствия РНК необходима обработка РНКазой с последующей очисткой.
Если вы решили выделять ДНК самостоятельно, то прежде чем отсылать образцы необходимо предоставить:
1) Электрофорез ПЦР-фрагментов, полученных с выделенной ДНК. Количество циклов должно быть не более 30. Должен присутствовать отрицательный контроль (ПЦР с воды). Обязательно должен быть нанесен маркер длин.
2) Спектр поглощения (200-300 нм) образцов ДНК (например на Nanodrop). Спектр должен быть классическим с максимумом на 260 нм и минимумом на 230 нм. Соотношение A260/ A280 ~1.6-1.8, а A260/ A230 в пределах 2-2.2. Неклассический спектр означает, что вам необходимо провести дополнительную очистку переосаждением или другим способом.
3) Флуориметрическое измерение общего количества ДНК, например, на Qubit (Thermo Fisher Scientific). Очень желательно, чтобы ДНК было не менее 10 нг и это значение не должно отличаться более чем на 20% от количества определенного при A260 на спектрофотометре.
4) В том случае, если спектр поглощения был классический, но отличия (Nanodrop/Qubit) тем не менее значительные, это с большой вероятностью связано c наличием в образце РНК. Необходимо проверить этот факт, проведя измерение РНК на Qubit (Thermo Fisher Scientific). В случае подтверждения присутствия РНК необходима обработка РНКазой с последующей очисткой.
