Программа обучения
Программа курса стажировки специалистов и обучения основам анализа продуктов реакции Сэнгера и фрагментного анализа на генетических анализаторах ABI PRISM 3130 Avant производства фирмы Applied Biosystems. program.doc
Пожалуйста, обратите внимание, что обучение проводиться только для пользователей ЦКП «Геномика»
Пожалуйста, обратите внимание, что обучение проводиться только для пользователей ЦКП «Геномика»
Основы пробоподготовки для анализа на автоматических генных анализаторах фирмы Applied Biosystems
- Основы теории и оптимизации ПЦР в приложении к секвенированию. Компоненты реакционной смеси их расход. Кинетика реакции, понятие о плато и оптимуме условий
- Поставить ПЦР на градиентном амплификаторе для подбора оптимальных условий
- Наиболее частые загрязнения р-ров плазмид и ПЦР реакций. Влияние этих загрязнений на течение реакции Сэнгера (кратко). Методы очистки матрицы перед реакцией Сэнгера (ферментативные, переосаждение, сорбция, гельфильтрация). Их достоинства и недостатки
- Очистка плазмиды для реакции Сэнгера: обработка РНКазой и гельфильтрация на колонках Centricep или G100
- Ответы на вопросы
- Заливка агарозного геля и электрофорез продуктов ПЦР с градиентного амплификатора. Анализ результатов и выбор оптимальных условий
- Поставить препаративную ПЦР по оптимальным условиям
- Особенности очистки ампликонов перед реакцией Сэнгера
- Реакция Сэнгера: краткая теория
- Очистка ампликонов на колонках GFX
- Постановка реакции Сэнгера
Анализ результатов секвенирования. Фрагментный анализ
Иллюстрации: диски к приборам, показательные файлы секвенирования
Протоколы: ПЦР с меченными праймерами
Иллюстрации: диски к приборам, показательные файлы секвенирования
Протоколы: ПЦР с меченными праймерами
- Теория и практика совмещены на полученных последовательностях
- Сырые данные (Raw Data)
- Восстановление нуклеотидной последовательности (basecalling). Понятие спейсинга. Специальные и адаптивные подпрограммы
- Протоколы SeqAn v. 5.x. Автоматическое определение границ обсчитываемой области, критерий качества (Qv), смешанные основания
- Интерпретация результатов и анализ их достоверности (средняя величина сигнала, сигнал/фон, наличие солей, ингибиторов, невключившихся [F]ddNTPs, малое количество матрицы, загрязнение РНК, загрязнение вторым праймером, «-1» праймер, продуктами деградации праймера, негомогенная матрица, мутации)
- Ручная корректировка параметров обсчёта (границы, спейсинг, подпрограмма, «внутренние имена»)
- Служебная информация в файлах *.abi, *.ab1
- Альтернативное ПО для просмотра результатов
- Основной принцип. Внутренние стандарты длин. Метка: праймер или [F]dNTP. Чем лучше праймер (мечение одной цепи, известный заряд-подвижность, нет необходимости в очистке). Требования к полимеразе, варианты оптимизации
- ПЦР на STR и VNTR повторы PAH c 5’(5,6)FAM праймерами
- ПЦР с меченным праймером. Необходимость многократного разбавления: минимальные затраты не реактивы, нет необходимости в очистке)
- Подбор условий нанесения. Динамический диапазон. Оценка полноты реакции. Конкуренция между стандартом и исследуемыми фрагментами и солями. Редактирование модулей
- Нанесение продуктов ПЦР с меченными праймерами на генные анализаторы для проведения фрагментного анализа
- Денатурирующие и неденатурирующие условия фореза. Разница в разрешении и возможности деления цепей. Особенности фирменных стандартов длин в зависимости от типа (меченые по одной или двум цепям) в денатурирующих и неденатурирующих условиях. Варианты нанесения из воды и формамида на те и другие полимеры
- Каналы детекции и виртуальные фильтры
- Стандарты длин. Собственные и фирменные. Особенности стандартов длин в зависимости от типа (меченые по одной или двум цепям) в денатурирующих и неденатурирующих условиях. Аномальная подвижность фрагментов
Фрагментный анализ: интерпретация результатов
Иллюстрации: диски к приборам, показательные файлы секвенирования, ноябрьский опыт
Иллюстрации: диски к приборам, показательные файлы секвенирования, ноябрьский опыт
- Сырые данные. (Raw Data).
- Анализ в программах Gene Mapper и Peak Scanner. Параметры обсчёта. Алгоритмы определения размеров. Принципиальная относительность полученных размеров.
- Основные проблемы при обсчёте (аномальная подвижность фргментов, оценка полноты протекания реакции, эффективность протекания реакции, безматричный синтез «А», «проскальзывание полимеразы».
- Альтернативное ПО для просмотра результатов
- Особенности систем гель-документации на примере системы Bio-Rad Gel-Doc. Основное программное обеспечение. Использование программного обеспечения сторонних производителей для конкретных задач
- Повторение основных протоколов. Обсуждение вопросов, возникших на базе полученных знаний. Самостоятельная практическая работа с приборами и анализ полученных данных
